V hre Macbeth hrá Lady Macbeth kľúčovú úlohu v smrti kráľa Duncana. Je to ona, kto presvedčí Macbetha, aby zavraždil kráľa, a pomáha mu naplánovať a vykonať čin.
Keď Macbeth vyjadrí svoje pochybnosti a obavy zo zabitia kráľa, lady Macbeth mu vyčíta, že je zbabelec a zahanbí ho, aby spáchal zločin. Poukáže na to, že už mal nápad zabiť Duncana a že váha len kvôli svojej „slabej povahe“. Tiež mu pripomína jeho ambíciu stať sa kráľom a hovorí mu, že ak chce dosiahnuť svoje ciele, musí byť nemilosrdný.
Odhodlanie a manipulácia Lady Macbeth nakoniec presvedčia Macbetha, aby súhlasil s jej plánom. Uvádza podrobnosti o vražde vrátane toho, ako a kedy by mala byť vykonaná. Tiež povie Macbethovi, aby nechal krvavé dýky pri Duncanovom tele, aby vina padla na kráľove stráže.
Po spáchaní vraždy je Lady Macbeth spočiatku presvedčená, že sa im ju podarí ututlať. Čoskoro však začne vykazovať známky viny a šialenstva. Je posadnutá krvou na rukách a nemôže spať. Začína mať tiež vízie ducha Duncana, ktorý ju obviňuje z vraždy.
Vina Lady Macbeth sa nakoniec stane príliš veľkou na to, aby ju znášala. Umiera vo štvrtom dejstve hry a jej smrť je pre Macbetha zlomová. Stáva sa ešte bezohľadnejším a tyranským a nakoniec príde o rozum.
Úloha lady Macbeth pri smrti kráľa Duncana je významná, pretože poukazuje na silu ambícií a na nebezpečenstvo, keď dovolíte, aby vlastné túžby prekonali svoje morálne zásady. Je to zložitá a tragická postava, ktorú nakoniec zničí jej vlastné ambície a vina.