Florey sa narodil v Adelaide v Južnej Austrálii ako syn riaditeľa školy. Navštevoval St Peter's College v Adelaide a University of Adelaide, kde v roku 1921 získal titul bakalár prírodných vied a v roku 1924 doktorát medicíny.
Po ukončení lekárskeho diplomu Florey pracoval na Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research v Melbourne, kde sa stretol s Ernstom Chainom. V roku 1928 sa presťahovali na Sir William Dunn School of Pathology na Oxfordskej univerzite, kde začali pracovať na vývoji penicilínu.
Penicilín objavil v roku 1928 Alexander Fleming, ale nevyvinul sa z neho použiteľný liek. Floreymu a Chainovi sa podarilo izolovať účinnú látku penicilín a vyčistiť ju tak, aby sa mohla podávať pacientom injekčne. Vyvinuli tiež metódy na hromadnú výrobu penicilínu, čo umožnilo jeho široké využitie počas druhej svetovej vojny.
Práca Floreyho a Chaina o penicilíne zachránila počas druhej svetovej vojny nespočetné množstvo životov a spôsobila revolúciu v liečbe infekčných chorôb. Florey získal Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu v roku 1945 a v roku 1944 bol pasovaný za rytiera.
Florey bol tiež uznávaným správcom a pedagógom. V rokoch 1959 až 1962 pôsobil ako vicekancelár Oxfordskej univerzity a v rokoch 1960 až 1965 bol prezidentom Kráľovskej spoločnosti v Londýne. Bol tiež členom Austrálskej akadémie vied, Americkej akadémie umení a vied. a Národná akadémia vied.
Florey zomrel na mŕtvicu v Oxforde v roku 1968. Je považovaný za jedného z najvýznamnejších austrálskych vedcov 20. storočia a jeho práca o penicilíne zachránila milióny životov.